Il museo, voluto nel Settecento dal granduca Pietro Leopoldo come raccolta di dipinti, fu scelto nel 1873 per esporvi il David di Michelangelo, spostato dalla sua collocazione all’aperto in Piazza Signoria. Il grande capolavoro, espressione del genio del giovane Michelangelo e simbolo della libertà della Repubblica Fiorentina ai primi del Cinquecento, domina la sala appositamente costruita dall’architetto De Fabris.
Qui sono in seguito pervenute altre statue di Michelangelo che hanno definitivamente trasformato la Galleria in museo michelangiolesco: i quattro Prigioni incompiuti, destinati alla tomba di papa Giulio II, ma mai spediti a Roma, il San Matteo per il Duomo di Firenze, anche questo non finito, e la Pietà di Palestrina, attribuita a Michelangelo maturo.